用了許多方法檢測小鼠的肝臟、腦部、睪丸等組織的細胞凋亡，其中 TUNEL 法做的多，我購買(mǎi)的試劑盒主要是 roche、 promega 公司，結果大多數成功，偶爾也有失敗，下面我把實(shí)驗中的關(guān)鍵問(wèn)題與大家共享一下，同時(shí)也希望能對初學(xué)者有所幫忙。

ATCC細胞 TUNEL實(shí)驗中關(guān)鍵步驟

1.充分脫蠟和水化

脫蠟可以先 60oC 20 min；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗，這些以便后面的結合反應充分、均勻；

2.把握好細胞通透的時(shí)間

一般根據切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時(shí)間，常用 10-30 min，幾 μm 切片用短時(shí)間；幾十 μm 切片用長(cháng)時(shí)間，通過(guò)摸索達到既不脫片，有能夠使后面的酶和抗體進(jìn)入胞內。

3.適當延長(cháng) TUNEL 反應液的時(shí)間

一般是37oC 1 h，你也可以根據你的凋亡損傷程度，選擇更長(cháng)的時(shí)間，可長(cháng)至 2 h，但要結合你終的背景著(zhù)色。

4.DAB 顯色條件的選擇

一般 DAB 反應10 min 左右，結合鏡下控制背景顏色，長(cháng)不超過(guò) 30 min；promega 公司提供的 DAB 液（桃紅色），不利于辨認棕褐色，我不太喜歡。

5.PBS 的充分清洗

在 TUNEL 反應后和酶標反應后的清洗應十分嚴格，可增加次數達 5 次，因為這些清洗直接決定后切片的非特異性著(zhù)色。

6.內源性 POD 的封閉

對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織，我的經(jīng)驗是適當延長(cháng)封閉時(shí)間和升高過(guò)氧化氫的濃度，可以達到很好的封閉效果，且不影響終的特異性染色。

TUNEL法的實(shí)驗原理

      ATCC細胞 基本原理：對不同組織切片先增加細胞膜通透性，然后讓 rTDT 和生物標記的 dTUTP 進(jìn)入細胞內，在 rTDT 的輔助下 dTUTP 與核斷裂的 DNA 3’-OH 結合，再用 HRP 標記的鏈霉親和素與 dTUTP 上的 biotin 結合（每個(gè)鏈霉親和素至少可以再結合 3 個(gè) biotin 分子），后用 DAB、過(guò)氧化氫與 SP 上的辣根過(guò)氧化物酶HRP發(fā)生氧化、環(huán)化反應，形成苯乙肼聚合物而呈現棕褐色，終通過(guò)計數每張切片上不同視野中 TUNEL 陽(yáng)性細胞的比例來(lái)判斷細胞凋亡發(fā)生情況。（小編碎碎念：掌握原理是做好實(shí)驗的先決條件，不少人還以為是抗體抗原反應呢）

       細胞通透的時(shí)間選擇

       1.蛋白酶 k 的目的是通透細胞膜和核膜，從而使反應試劑充分進(jìn)入細胞核進(jìn)行反應，提高陽(yáng)性率。但濃度過(guò)高或孵育時(shí)間太長(cháng)容易脫片，只要不脫片，好像影響不大，其作用類(lèi)似與 TritonX100 等細胞通透劑。

       2. 蛋白酶K一般工作液濃度為 20 μg/ml,但濃縮液可配制1-10 mg/ml，可用 PBS 配制，也可用蛋白酶K緩沖液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）；然后分裝成小份，用完一支再用下一支，-20oC保存 1 個(gè)月應該沒(méi)問(wèn)題的（重復拿的那支），而一直冷凍的至少可以用半年以上。

       3. 蛋白酶K反應時(shí)間一般為10-30 min，具體時(shí)間長(cháng)短與切片厚薄有關(guān)，4 μm左右的片子可以用 10 min，但30 μm左右的可用30 min，終通過(guò)摸索jia時(shí)間。過(guò)長(cháng)易脫片、過(guò)短起不到通透效果。

關(guān)鍵試劑操作條件

       DAB 顯色反應大約需要10 min，要控制好反應時(shí)間，勿使背景顏色過(guò)深。具體的可能還是得根據切片組織來(lái)源和切片厚度、試劑盒種類(lèi)不同來(lái)摸索一下。

蛋白酶K工作液處理時(shí)間、溫度須在范圍內摸索，溫度過(guò)高，時(shí)間過(guò)長(cháng)，易破壞核酸結構，出現假陽(yáng)性。

       DNase 1 一般室溫，10 min 即可。

 如何減弱非特異性染色

       若是肝臟或腎臟，因富含內源性過(guò)氧化物酶，需要增加過(guò)氧化氫濃度和延長(cháng)孵育時(shí)間。其他還可以加強滅活、縮短 DAB 孵育時(shí)間、PBS 充分清洗，注意鏡下把握好著(zhù)色。

其他注意事項

       1.濕盒用帶蓋方盤(pán)，里面固定幾根玻璃吸管用于放玻片，使用時(shí)稍加水即可。

       2.英文說(shuō)明書(shū)中對組織細胞通透這一步中，加了“對難處理的組織的處理”，意思是用常規方法處理（如蛋白酶 K)后，應該陽(yáng)性而做不出陽(yáng)性時(shí)，可用微波修復。

       3.復染的目的是為了襯托組織形態(tài)結構，以利于結果分析，石蠟切片常用蘇木素，核染成蘭色，冷凍切片常用甲基綠，核染成綠色。

       4.PBS 用蒸餾水、Na2HPO4、KH2PO4配制，現在有賣(mài)的，自己加蒸餾水稀釋后即可用，很方便，也不貴。蛋白酶 K 消化蛋白后，需要用封閉液。

       5. 未打開(kāi)的試劑盒貯存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解凍，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 m內穩定，避免再次凍存；TUNEL反應液臨用前配好后，放至冰上直至使用。

       6. 結果分析時(shí)注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細胞中可產(chǎn)生大量DNA斷，從而引起假陽(yáng)性結果；而有些類(lèi)型的凋亡性細胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不*，以及細胞外的矩陣成分阻止TdT進(jìn)入胞內反應，進(jìn)而產(chǎn)生假陰性結果

       7.棕色是陽(yáng)性細胞沒(méi)錯；棕色+藍色的細胞核為藍黑色，趨黑色，所以是可以判斷的。如果結果片子全是藍色的，那就是說(shuō)沒(méi)有陽(yáng)性細胞核。實(shí)驗失敗。陽(yáng)性細胞核可以被染上，只不過(guò)是藍黑色而已。注意分辨。Tunel后鏡檢一下看看陽(yáng)性細胞核在什么位置；然后再輕度復染即可。注意比較分辨哪些是陽(yáng)性細胞。